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《牛新孢子蟲病間接ELISA 診斷方法的建立及初步應用》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、+分類號：R852.723密級：公開UDC：2008屆攻讀碩士學位研究生學位(畢業(yè))論文牛新孢子蟲病間接ELISA診斷方法的建立及初步應用DevelopmentandpreliminaryapplicationofindirectELISAdiagnosticmethodforneosporosisincattle學科、專業(yè)：預防獸醫(yī)學研究方向：獸醫(yī)寄生蟲學與寄生蟲病學研究生：翟延慶指導教師：王春仁教授完成日期：2008年4月中國大慶牛新孢子蟲病間接ELISA診斷方法的建立及初步應用Developmentandprelimina
2、ryapplicationofindirectELISAdiagnosticmethodforneosporosisincattle本研究受大慶市科學技術計劃項目課題名稱：大慶市奶牛原發(fā)性流產(chǎn)病因分析與防制技術體系的建立課題編號：SGG2005-032項目資助研究生姓名：翟延慶年級：二○○五級導師：王春仁教授申請學位：農(nóng)學碩士起止日期：2005.10－2008.4黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院二○○八年四月獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方
3、外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得黑龍江八一農(nóng)墾大學或其它教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：時間：年月日關于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解黑龍江八一農(nóng)墾大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權(quán)保留送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。同意黑龍江八一農(nóng)墾大學可以用不同方式在不同刊物上發(fā)表，傳播學位論文的全部或部分內(nèi)容。(保密的學位論文在解密后
4、應遵守此協(xié)議)研究生簽名：時間：年月日導師簽名：時間：年月日中文摘要新孢子蟲病是由犬新孢子蟲（Neosporacaninum）寄生于牛、羊、犬等多種動物細胞內(nèi)引起的一種原蟲病。新孢子蟲病可以引起新生兒的運動障礙和神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及孕畜流產(chǎn)、死胎，尤其是奶牛的流產(chǎn)，給畜牧業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。新孢子蟲病的早期準確診斷是有效的控制該病的發(fā)生和蔓延的重要手段。因此，本試驗擬采用新孢子蟲表面蛋白NcSRS2建立間接ELISA診斷方法，用于牛新孢子蟲病診斷。TM本試驗根據(jù)GenBank上發(fā)表的新孢子蟲NcSRS2序列，設計合成一對引物，以
5、新孢子蟲總核酸為模板，PCR方法擴增NcSRS2基因，與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化到JM109宿主菌中，獲得陽性重組質(zhì)粒pMD18-T-NcSRS2。將重組質(zhì)粒pMD18-T-NcSRS2進行亞克隆，祛除信號肽和疏水端得到陽性質(zhì)粒pMD18-T-NcSRS2t。陽性質(zhì)粒pMD18-T-NcSRS2t和表達載體pET-28a（+），經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后回收，連接，轉(zhuǎn)化到JM109宿主菌，提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到最佳宿主菌BL21（DE3）中，構(gòu)建含有NcSRS2t基因表達載體的重組菌株BL21（pET-
6、28a-NcSRS2t）。經(jīng)酶切鑒定和DNA序列分析證實，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-NcSRS2t中含有NcSRS2t基因，且基因序列和閱讀框架均正確。將重組菌株BL21（pET-28a-NcSRS2t）按1%的量接種到含有Kan（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2.5h，然后用1mmol/LIPTG誘導4h，融合蛋白NcSRS2t獲得高效表達。經(jīng)Westernblot檢測，重組菌株表達的融合蛋白能夠被新孢子蟲特異性抗體所識別。以純化的重組蛋白NcSRS2t作為抗原包被酶標板，通過對間接ELISA各反應條件
7、的優(yōu)化，確定了最佳反應條件為：抗原的最佳包被液為50mMpH9.6的碳酸鹽緩沖液；抗原最佳包被濃度為5.0μg/mL；最佳封閉液為5%脫脂奶粉，封閉條件為37℃1h；最佳血清稀釋液為5%脫脂奶粉，血清稀釋倍數(shù)為100倍；HRP-兔抗牛IgG的最適工作濃度為1：5000。采用已確立的間接ELISA反應條件，對218份陰性血清的檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，確定了間接ELISA方法判定標準，即OD450值大于等于0.32為陽性，小于0.32為陰性。應用建立的間接ELISA方法對128份陰性血清和50份陽性血清（經(jīng)IDEXX公司新孢子蟲抗體
8、檢測試劑盒證實）的檢測結(jié)果表明，ELISA方法的特異性為93.0%，敏感性為90.0%。采用本試驗建立的新孢子蟲病間接ELISA診斷方法對黑龍江省的克山、海林、雙城、甘南、克東、富裕、牡丹江、大慶等8個縣（市）奶牛場的540份奶牛血清進行了檢測。結(jié)果表明，黑龍江
