牛微小隱孢子蟲感染ELISA和膠體金層析試紙條檢測(cè)方法的建立

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1、分類號(hào)：S855.9+9單位代碼：10183研究生學(xué)號(hào)：2016854016密級(jí)：公開吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文（專業(yè)學(xué)位）牛微小隱孢子蟲感染ELISA和膠體金層析試紙條檢測(cè)方法的建立DevelopmentofELISAandColloidalGoldImmunochromatographicStripsforTheDetectionofCryptosporidiumparvuminbovine作者姓名：邰利鑫類別：獸醫(yī)碩士領(lǐng)域（方向）：疫病防控指導(dǎo)教師：張西臣教授培養(yǎng)單位：動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院2018年6月牛微小隱孢子蟲感染

2、ELISA和膠體金層析試紙條檢測(cè)方法的建立DevelopmentofELISAandColloidalGoldImmunochromatographicStripsforTheDetectionofCryptosporidiumparvuminbovine作者姓名：邰利鑫領(lǐng)域（方向）：疫病防控指導(dǎo)教師：張西臣教授類別：獸醫(yī)碩士答辯日期：2018年6月6日國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2017YFD0501305）Thisworkwassupportedby“TheNationalKeyResearchandDevelop

3、mentProgramofChina”(GrantNo.2017YFD0501305)未經(jīng)本論文作者的書面授權(quán)，依法收存和保管本論文書面版本、電子版本的任何單位和個(gè)人，均不得對(duì)本論文的全部或部分內(nèi)容進(jìn)行任何形式的復(fù)制、修改、發(fā)行、出租、改編等有礙作者著作權(quán)的商業(yè)性使用（但純學(xué)術(shù)性使。。用不在此限）否則，應(yīng)承擔(dān)侵權(quán)的法律責(zé)任吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明，，：所呈交學(xué)位論文是本人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果３除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其

4、他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明Ｄ本人完全意識(shí)到本聲明的法侓結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名曰期？（月？年／。曰中文摘要牛微小隱孢子蟲感染ELISA和膠體金層析試紙條檢測(cè)方法的建立隱孢子蟲病是一種呈全球分布的人獸共患寄生蟲病，牛可感染多種類型隱孢子蟲，主要包括安氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲、牛隱孢子蟲和瑞氏隱孢子蟲等，其中微小隱孢子蟲感染最為廣泛，犢牛感染后出現(xiàn)腹瀉、營(yíng)養(yǎng)不良等癥狀，且對(duì)人類健康危害最為嚴(yán)重。近年來隨著養(yǎng)牛業(yè)的

5、迅速發(fā)展，牛成為人患微小隱孢子蟲病的主要來源，且目前尚無微小隱孢子蟲的特效藥物和疫苗，所以建立快速準(zhǔn)確的牛微小隱孢子蟲診斷方法，對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康安全意義重大。近年來發(fā)現(xiàn)在微小隱孢子蟲的卵囊中存在一種病毒，即為微小隱孢子蟲病毒（Cryptosporidiumparvumvirus,CSpV1），其在卵囊中存在穩(wěn)定，且數(shù)量較多，可作為牛感染微小隱孢子蟲的重要檢測(cè)指標(biāo)。本研究選用實(shí)驗(yàn)室制備保存的微小隱孢子蟲病毒單克隆抗體作為捕獲抗體，本實(shí)驗(yàn)制備的兔抗微小隱孢子蟲病毒衣殼蛋白多克隆抗體作為檢測(cè)抗體，建立三種檢測(cè)牛

6、糞便樣品的微小隱孢子蟲感染免疫學(xué)診斷方法并進(jìn)行對(duì)比分析，為今后牛微小隱孢子蟲的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供參考。雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法的建立：首先表達(dá)微小隱孢子蟲病毒衣殼蛋白，制備并純化出兔抗微小隱孢子蟲病毒衣殼蛋白多克隆抗體，以微小隱孢子蟲病毒5#單克隆抗體作為捕獲抗體，HRP標(biāo)記兔抗微小隱孢子蟲病毒衣殼蛋白多克隆抗體作為檢測(cè)抗體，建立牛微小隱孢子蟲感染雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法。通過各項(xiàng)條件的摸索優(yōu)化，確定微小隱孢子蟲病毒單克隆抗體的最佳包被量為0.25μg/孔；待檢糞便樣品的最佳稀釋度為1：4稀釋；HRP標(biāo)記兔抗微小隱

7、孢子蟲病毒衣殼蛋白多克隆抗體的最佳稀釋度為1：200；敏感度可達(dá)到1：160；選取牛安氏隱孢子蟲感染陽(yáng)性參照糞便樣品和牛賈第蟲感染陽(yáng)性參照糞便樣品進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果未出現(xiàn)交叉反應(yīng)；采用不同批次的酶標(biāo)板進(jìn)行批間和批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)小于6%，批間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)小于9%；應(yīng)用已建立的牛微小隱孢子蟲雙抗夾心ELISA方法，檢測(cè)長(zhǎng)春地區(qū)120I份糞便樣品，并與市售微小隱孢子蟲雙抗夾心ELISA試劑盒作為比較，本方法檢測(cè)出6份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為5%(6/120)，市售ELISA試劑盒檢出4份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)

8、性率為3%(4/120)。Dot-ELISA檢測(cè)方法的建立：使用NC膜作為載體，利用微小隱孢子蟲病毒5#單克隆抗體和HRP標(biāo)記的兔抗微小隱孢子蟲病毒衣殼蛋白多克隆抗體建立牛微小隱孢子蟲感染Dot-ELISA檢測(cè)方法。確定糞便樣品的最佳稀釋比例是1：16；HRP標(biāo)記微小隱孢子蟲病毒多抗最佳稀釋比例為1：500；微小隱孢子蟲病毒單克隆抗體的最佳包被量0.5μg/片；敏感性為1