基因診斷(1)教程文件.ppt

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1、基因診斷(1)傳統(tǒng)的診斷１、問、望、聽、觸…—經(jīng)驗(yàn)型判斷的方法。２、化驗(yàn)/檢驗(yàn)——細(xì)胞、組織、大分子、小分子、酶、代謝物；微生物、免疫學(xué)、生物化學(xué)、病理學(xué)等。３、影像學(xué)—X線、B超、CT、核磁共振、內(nèi)窺鏡等。４、特殊檢查—染色體檢查、肌電/腦電/心電、骨密度、原子吸收光譜等。隨著技術(shù)水平的發(fā)展，這些診斷方法也在不斷的提高和完善，在醫(yī)學(xué)實(shí)踐中發(fā)揮了巨大的作用。并還將有更先進(jìn)的方法問世。但這些方法大多存在一個(gè)無法克服的缺陷：不可預(yù)先診斷。隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明，絕大多數(shù)疾病的發(fā)生和發(fā)展都與患者的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能改變有關(guān)，所以遺傳物質(zhì)

2、的檢查越來越顯得必要?；蛟\斷的定義應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能變化而作出的或輔助臨床診斷的技術(shù)，稱為基因診斷?；蛟\斷具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、費(fèi)用低，并對(duì)許多疾病特別是遺傳性疾病做出預(yù)先診斷的優(yōu)點(diǎn)。它是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ脑\斷方法。由于基因診斷發(fā)展的時(shí)間不長，人們對(duì)于基因，特別是致病基因的了解還有許多空白，因此許多疾病的診斷還主要依靠其他方法。此外，基因診斷的發(fā)展并非取代和拋棄其他方法，而是相互補(bǔ)充，共同發(fā)展。長期以來，單基因遺傳病的診斷主要靠臨床觀察和一系列生化檢查，但生化學(xué)檢查要求有相應(yīng)基因表達(dá)產(chǎn)物的體液或細(xì)胞，并對(duì)基因產(chǎn)物或代謝異常

3、機(jī)理有所了解。但對(duì)絕大多數(shù)遺傳病而言，目前還遠(yuǎn)未達(dá)到這種認(rèn)識(shí)。。理想的診斷方法是對(duì)患者基因或DNA本身直接進(jìn)行分析，因?yàn)檫@種分析擺脫了上述各種限制。機(jī)體各種組織的核細(xì)胞均有全套基因組DNA，可以作為分析的材料，而不必考慮表達(dá)問題，是目前診斷技術(shù)中最具發(fā)展前途的技術(shù)。診斷方法的變更基因診斷的對(duì)象1.病原生物的侵入，如肝炎、艾滋病、支原體、細(xì)菌、寄生蟲。2.先天遺傳性疾患，如苯丙酮尿癥、無丙種球蛋白血癥。3.后天基因突變引起的疾病，如腫瘤。4.其它，如親子鑒定、個(gè)體識(shí)別、法醫(yī)物證。與疾病相關(guān)的遺傳物質(zhì)改變主要有兩類，1.遺傳物質(zhì)，即DNA或RNA的水平的變化。如病

4、毒感染時(shí)病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在人體內(nèi)的從無到有，某些腫瘤中癌基因表達(dá)水平的從低到高。2.遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，即基因突變。如點(diǎn)突變引起的基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起的基因激活或滅活等等。因此，從理論上說，所有涉及基因結(jié)構(gòu)和功能變化的檢測(cè)都屬于基因診斷?；蛟\斷的內(nèi)容常用基因診斷的技術(shù)1.Hybridization2.PCR3.RFLP4.AFLP5.ASO6.SSCP每個(gè)人的DNA是不完全相同的，一般每100－500bp就有一個(gè)是不相同的，即多態(tài)性。在兩套基因組DNA中平均有1000萬處不同，它們多位于內(nèi)含子序列中。堿基的變異就可能導(dǎo)致酶切點(diǎn)的消失或新的切點(diǎn)出現(xiàn)，當(dāng)

5、使用同一限制酶切割不同個(gè)體基因組DNA時(shí)，DNA片段長度出現(xiàn)差異，這種由于內(nèi)切酶切點(diǎn)變化所導(dǎo)致的DNA片段長度的差異，稱為限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）。RFLP反映了常見的個(gè)體間DNA核苷酸的可遺傳性變異，它按照孟德爾方式遺傳。RFLP可用Southern印跡雜交法檢出。1.RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)等位基因2由于出現(xiàn)新的切點(diǎn)，DNA片段縮至8kb。DNA片段電泳后雜交圖RFLP的檢出等位基因1因有額外切點(diǎn)而導(dǎo)致產(chǎn)生兩個(gè)長

6、短不同的DNA片段（3kb及5kb）且均能與探針雜交。在人類基因組中還存在一類DNA重復(fù)序列，稱為小衛(wèi)星DNA。它們分布十分廣泛，每個(gè)重復(fù)單位通常只有幾－－幾十個(gè)堿基對(duì)，但其重復(fù)次數(shù)在人群中是高度變異的，又叫數(shù)目變異的串聯(lián)重復(fù)（variablenumbertandemrepeats,VNTR）。當(dāng)用限制酶切割VNTR區(qū)時(shí)，只要酶切點(diǎn)不在重復(fù)區(qū)內(nèi)，就可能得到各種長度不同的片段，可用于致病基因的連鎖分析。串聯(lián)重復(fù)的短片段的長度多態(tài)性可以通過PCR擴(kuò)增后電泳來檢出，并用于致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）連鎖分析法。PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物

7、即等位片段之間的差別有時(shí)只有幾個(gè)核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析。2.AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymorphism）當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時(shí)，可以合成等位基因特異的寡核苷酸探針（allele-specificoligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素標(biāo)記進(jìn)行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測(cè)點(diǎn)突變時(shí)需要合成兩種或兩種以上的探針，一種與正?；蛐蛄型耆恢拢芘c之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定

8、雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，這